阿留申病病毒PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū) 使用方法： 測定法的靈敏度來(lái)自作為報告的酶。酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應，產(chǎn)生可供觀(guān)察的顯色反應現象。因此該體系常被稱(chēng)為酶放大體系。 1. 標準品的稀釋?zhuān)罕驹噭┖刑峁┰稑藴势芬恢?，用?hù)可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。 24μg/ml 5號標準品 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液 12μg/ml 4號標準品 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液 6μg/ml 3號標準品 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液 3μg/ml 2號標準品 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液 1.5μg/ml 1號標準品 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液 2. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。| 3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。 4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用 5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。 7. 溫育：操作同3。 8. 洗滌：操作同5。 9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘. 10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時(shí)藍色立轉黃色）。 11. 測定：以空白空調零，450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以?xún)冗M(jìn)行。 熒光定量PCR檢測方法包括以下步驟： (1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線(xiàn)； (2)待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線(xiàn)計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。 其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線(xiàn)。 其中所述參照基因為本領(lǐng)域常規參照基因，較佳地管家基因，地為RPPH1的擴增區域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，地為T(mén)A cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標準品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標準品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標準曲線(xiàn)法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問(wèn)題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性。 步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線(xiàn)計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。 其中所述待測目的基因為本領(lǐng)域常規待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴增區域，所述熒光定量PCR擴增為本領(lǐng)域常規熒光定量PCR擴增方法，所述熒光定量PCR擴增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴增。 實(shí)驗規則： 1、要保證移液槍的準確性，誤差不能超過(guò)2%?？捎盟碗娮犹炱竭M(jìn)行確定。但有專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行矯正。 2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標準品時(shí)。 3、要在實(shí)驗前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復到室溫，以使結果更穩定。 4、實(shí)驗時(shí)，要使底物避光保存。 5、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準確。 6、吸取液體時(shí)，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。 7、將液體加到酶標孔中時(shí)，避免槍頭和孔內液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(huì )自然流下去。 8、液體全部加完后，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒，混勻液體。也可以用酶標儀的晃動(dòng)功能。 9、應盡量做雙孔實(shí)驗，這樣才能保證數據的準確性。 10、對結果有疑問(wèn)的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。 實(shí)驗注意事項： 1）RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、細菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗前請充分溝通確認實(shí)驗方案和樣本情況； 2）客戶(hù)盡可能提供實(shí)驗的背景信息、物種、基因準確的名稱(chēng)和ID號； 3）客戶(hù)盡量不要提供DNA或RNA樣品。 4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，*通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類(lèi)和非探針類(lèi)兩類(lèi)，探針類(lèi)是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類(lèi)是利用熒光染料或者特異性設計的引物來(lái)指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析。 主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析、基因表達差異分析、基因分型。 主要技術(shù)：引物設計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。
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